Jurnal Teknik Bioproses


Resume: Discriminatory Power of Agarose Gel  Electrophoresis in DNA Fragments Analysis

 (Perbedaan Kekuatan Gel Agarosa dalam analisis Fragmen DNA)

By: Seow Van Lee dan Abdul Rani Bahama

Resume by: Zenith Tacia Ibanez/ 115100607111010/Biochemichal Engineer-FTP-Brawijaya University

13761815-placa-de-gel-de-agarosa-para-la-separacion-de-adn-despues-de-la-electroforesis

1.LATAR BELAKANG

     Analisis panjang polimorfisme fragmen restriksi (RFLP) dikenal untuk mengeksploitasi variasi dalam homolog urutan DNA. Bahkan, Teknik ini telah menjadi alat dasar dalam epidemiologi molekul dan studi filogenetik yang tumbuh pesat bersamaan dengan metode yang menggunaakan enzim retriksi. Sejumlah besar enzim yang tersedia dan sejauh mana metode ini telah dipraktekkan di seluruh dunia mengungkapkan bahwa RFLP didefinisikan dengan baik bagi berbagai jenis organisme.

      Umumnya, prosedur analisis RFLP melibatkan pencernaan fragmen DNA, diikuti dengan pemisahan melalui elektroforesis gel agarosa dan deteksi fragmen yang mengandung gen spesifik menggunakan salah satu dari beberapa metode, termasuk pewarnaan DNA dari gel. Sementara ini, metode pengisolasian DNA tersebut mudah untuk diadopsi, hasil yang diperoleh dapat diinterpretasikan secara langsung dengan kesalaham minim. Analisis enzim restriksi DNA kromosom sebagai alat karakterisasi dan diagnosis infeksi bakteri telah menjadi alat yang berharga selama beberapa dekade.

Meskipun demikian, perbaikan penting dilakukan untuk diagnosis yang lebih cepat dan akurat. Dalam prosedur isolasi DNA kromosom untuk bakteri kini sudah menjadi lebih maju, namun proses elektroforesis gel tetap tidak berubah. Perbaikan atas praktek konvensional diperlukan untuk pencapaian  yang lebih baik terhadap kekuatan elektroforesis gel agarosa dalam analisis fragmen DNA. Dalam kasus Variasi target yang umum, elektroforesis gel agarosa mungkin menawarkan satu-satunya sarana praktis positif deteksi, direproduksi serta karakterisasi. Oleh karena itu, hadir ideology baru yang dibuat dan dibahas dengan upaya untuk memperkuat diskriminatif kekuatan elektroforesis gel agarosa melalui modifikasi persiapan media agarosa.

 2.METODE YANG DIGUNAKAN DALAM PROSES ELEKTROFORESIS

Dalam analisis panjang polimorfisme fragmen restriksi (RFLP), gel agarosa telah menjadi alat penting dalam menggambarkan fragmen DNA berdasarkan ukuran fragmen dengan teknik eletroforesis. Secara keseluruhan, proses elektroforesis merujuk pada pergerakan sebuah partikel bermuatan melalui matriks dalam medan listrik, sedangkan mobilitas elektroforesis tergantung pada muatan netral dan pada radius molekul (Rickwood & Hames, 1982). Fragmen DNA target dipisahkan berdasarkan buffer, suhu dan waktu yang sama tetapi menggunakan gel yang berbeda konsentrasinya. Untuk agarosa, konsentrasi gel didefinisikan dalam g/100 ml (Hjertén, 1962). Sedangkan ukuran pori gel poliakrilamida dapat dikontrol oleh jumlah total akrilamida (% T, di mana T = total konsentrasi akrilamida dan bisacrylamide monomer) dan tingkat cross-linking (% C, di mana C = konsentrasi bisacrylamide)(Rüchel, 1978). Prosedur ini, pada kenyataannya, menyerupai proses penyaringan dimana gel bertindak sebagai media, mendefinisikan asam nukleat berdasarkan ukuran fragmen dalam merespon muatan listrik yang diterima.

3.PRINSIP KERJA ELEKTROFORESIS

Elektroforesis adalah gerakan partikel koloid relatif terhadap medium fluida di bawah pengaruh medan listrik yang seragam spasi. Fenomena elektrokinetik adalah pertama kali dicatat oleh Reuss tahun 1809 (Reuss, 1809), dan masih banyak digunakan dalam berbagai perangkat  dan proses untuk menghasilkan skala makro efek secara efisien. Contoh aplikasi dan operasi meliputi pengukuran, deposisi elektroforesis, sidik jari elektroforesis,serta elektroforesis gel.

Pada prinsipnya, Tegangan terapan, yang didefinisikan dalam V / cm, ditentukan mendasarkan pada jarak antara elektroda, bukan panjang gel. ketika power supply arus searah diberikan selama elektroforesis, air akan  mengalami elektrolisis, proton berkumpul di anoda sementara ion hidroksil di katoda. Efek ini mengarah ke ujung cathodal dari elektroforesis dan asam berada di bagian akhir anodal. Oleh karena itu penggunaan sistem buffer, diperlukan ketika molekul bermuatan dielektroforesis melewati media pemisahan. Molekul DNA terkena medan listrik ini dan akan bermigrasi ke arah anoda karena fosfat bermuatan negatif sepanjang rantai. Kecepatan migrasi dibatasi oleh gaya gesekan yang dikenakan oleh matriks gel. Karena distribusi fosfat adalah sangat teratur di seluruh panjang asam nukleat, molekul ini memiliki muatan konstan untuk rasio massa dan oleh karena itu, perjalanan melalui agarosa sebanding dengan tingkat tegangan (Sambrook & Russell, 2001). Secara umum, ukuran DNA-lah yang menentukan tingkat di mana melewati gel, sehingga memungkinkan pemisahan efektif DNA fragmen-panjang campuran dengan elektroforesis. Dalam rentang waktu,jika tegangan yang lebih tinggi diterapkan, maka semakin cepat sampel bermigrasi. Namun, jika tegangan terlalu tinggi, akan terjadi pergerakan yang over terutama untuk DNA  12-15 kb, sehingga dapat mengakibatkan kerusakan. Sebaliknya, bila tegangan yang terlalu rendah, mobilitas kecil ( 1 kb) DNA berkurang dan pelebaran pita akan terjadi karena dispersi dan difusi.. Pada dasarnya, mobilitas asam nukleat dalam gel juga dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti konsentrasi gel, ukuran dan konformasi, dengan sedikit pengaruh dari komposisi dasar atau urutannya. Konsentrasi agarosa memainkan peran penting dalam pemisahan elektroforesis. Porositas gel secara langsung berkaitan dengan konsentrasi agarosa dalam medium dan menentukan berbagai ukuran dari molekul DNA yang dapat diselesaikan secara memadai. Dalam ukuran tertentu, Fragmen DNA yang linier akan bermigrasi pada tingkat yang berbeda melalui gel yang mengandung berbagai konsentrasi agarosa .

13700944-agarose-gel-plate-for-dna-separation-via-electrophoresis

4.MANFAAT ELEKTROFORESIS DENGAN MENGUNAKAN GEL AGAROSA

Teknik biologi molekuler  saat ini sangat dibutuhkan terutama dalam penelitian variasi genetik,  hal ini bertujuan untuk menemukan jawaban mengapa gen dari suatu individu dengan individu lainnya berbeda, dan bagaimana memahami peristiwa tersebut agar dapat dimanfaatkan sebaik mungkin untuk perkembangan keilmuan yang mendukung kehidupan biologis. Tahapan awal yang perlu dilakukan adalah mengisolasi DNA dan kemudian mengidentifikasi urutan DNA. Elektroforesis yang menggunakan gel agarosa adalah metode mendasar dalam semua penyelidikan ilmiah yang melibatkan asam nukleat termasuk untuk mengidentifikasi urutan DNA. Dalam analisis isolasi DNA kromosom, metode ini telah menjadi alat berharga untuk mengidentifikasi gen yang mengalami gangguan, pemetaan genom, penentuan penyakit, tes DNA, pembuatan vaksin dan awal tahapan untuk membentuk DNA rekombinan.

5. KELEBIHAN GEL AGAROSA SEBAGAI MEDIA DALAM PROSES ELEKTROFERESIS

Elektroforesis gel agarosa adalah teknik untuk mengidentifikasikan urutan DNA dengan cara pemisahan dan pemurnian Asam nukleat serta RFLP-analisis (Sambrook & Russell, 2001). Berbeda dengan gel poliakrilamida, resolusi gel agarosa lebih rendah tetapi memiliki rentang yang lebih besar pemisahannya. Fragmen DNA Kecil (50-20,000 bp) yang terbaik diisolasi dalam gel agarosa dengan berjalan secara horisontal dengan konfigurasi medan listrik dengan arah dan kekuatan yang konstan. Secara umum, metode ini langsung dianggap alat rutin dasar yang merupakan bagian integral dalam laboratorium molekuler dan dapat dikuasai dalam waktu singkat. Selain itu, agarosa gel yang mudah dialihkan dan ditangani dibandingkan dengan matriks lain, sehingga itu menjadi salah satu dari  sifat fisik metode standar untuk bekerja dengan protein dan asam nukleat.

Dalam prosedur melibatkan asam nukleat, agarosa sebagian besar menjadi matriks  yang disukai karena bermuatan netral. kimia inert dan tidak menunjukkan electroendosmosis (EEO), sehingga lebih kecil kemungkinannya untuk berinteraksi dengan biomolekul atau zat lain. Selama elektroforesis, DNA dipaksa bermigrasi melalui cross-linked agarosa matriks yang sangat peka dalam menanggapi arus listrik. Migrasi dari molekul DNA terhadap anoda (Kutub positif) terjadi terutama disebabkan oleh muatan negatif alami dilakukan oleh ikatan gula fosfat (Lodish et al, 2000.)

Artikel Terkait: Blog Brawijaya Zenith

Ada Komentar ?

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s